本(ben)試(shi)劑盒(he)用于(yu)體外定量檢測血清、血漿(jiang)(jiang)、組織勻漿(jiang)(jiang)及相(xiang)關液體樣本(ben)中人Ⅴ型膠原(yuan)(COL5)的含量。

有效期(qi)：6個(ge)月

保(bao)存條件：2-8℃

人Ⅴ型(xing)膠(jiao)原(COL5)試劑盒組成：

備注：

1.（96T/48T）打開包裝后請及(ji)時檢查所有物品(pin)是(shi)否(fou)齊全(quan)。

2. 標(biao)準品濃度依次(ci)為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經過大量正常(chang)標(biao)(biao)本檢驗(yan)，標(biao)(biao)本的正常(chang)濃度值(zhi)均在試(shi)劑盒(he)提供的檢測(ce)范圍內，實驗(yan)過程(cheng)中直接取50μL樣(yang)(yang)本上樣(yang)(yang)即(ji)可。當(dang)(dang)有部分樣(yang)(yang)本值(zhi)超(chao)過標(biao)(biao)準品濃度時，可用樣(yang)(yang)本稀釋液(ye)將標(biao)(biao)本進行(xing)適當(dang)(dang)稀釋后再(zai)進行(xing)實驗(yan)。

檢測前準備工(gong)作：

1.請提前20分鐘從冰箱(xiang)中取出試劑盒，平衡至室溫。

2.從(cong)冰箱中取出的(de)濃(nong)縮洗(xi)滌(di)(di)液(ye)可能有結晶，屬于正常現象(xiang)；放(fang)置(zhi)室(shi)溫，輕搖均勻，待結晶溶解后再配置(zhi)洗(xi)滌(di)(di)液(ye)。可將20ml濃(nong)縮洗(xi)滌(di)(di)液(ye)用(yong)蒸餾水或去(qu)離子水稀(xi)釋配置(zhi)成400ml工(gong)作濃(nong)度的(de)洗(xi)滌(di)(di)液(ye)，未用(yong)完的(de)放(fang)回4℃

3.20×洗(xi)滌緩(huan)(huan)沖液的稀釋：蒸餾(liu)水按1：20稀釋，即1份(fen)20×洗(xi)滌緩(huan)(huan)沖液加19份(fen)蒸餾(liu)水。

實驗(yan)原理(li)：

試(shi)劑盒采用(yong)(yong)雙抗(kang)體(ti)一步夾心法酶(mei)(mei)聯免疫吸附(fu)試(shi)驗（ELISA）。往(wang)預先包被人Ⅴ型(xing)膠原(yuan)(COL5)捕獲抗(kang)體(ti)的(de)(de)包被微孔中(zhong)，依次加入標本、標準品(pin)、HRP標記的(de)(de)檢測(ce)抗(kang)體(ti)，經過溫育并洗滌。用(yong)(yong)底物(wu)TMB顯(xian)色(se)，TMB在過氧(yang)化物(wu)酶(mei)(mei)的(de)(de)催化下轉化成藍色(se)，并在酸(suan)的(de)(de)作用(yong)(yong)下轉化成的(de)(de)黃色(se)。顏色(se)的(de)(de)深淺和樣品(pin)中(zhong)的(de)(de)人Ⅴ型(xing)膠原(yuan)(COL5)呈正相(xiang)關。用(yong)(yong)酶(mei)(mei)標儀在450nm 波長下測(ce)定吸光度(du)（OD 值），計(ji)算樣品(pin)濃(nong)度(du)。

實驗所需(xu)自備(bei)試驗器材：

1.酶標儀（450nm）

2.高精度(du)加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱(xiang)

4.蒸(zheng)餾水或(huo)去離子水

人Ⅴ型膠原(COL5)試(shi)劑(ji)盒樣本處理(li)及要求：

1.血清(qing)：將收集于血清(qing)分離管的(de)全血標本在室溫放置(zhi)2小時或4℃過夜(ye)，然后1000×g離心20 分鐘，取上(shang)清(qing)即(ji)可，或將上(shang)清(qing)置(zhi)于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍(dong)融。

2.血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采(cai)集標(biao)本，并將標(biao)本在采(cai)集后的30分鐘內(nei)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上(shang)清(qing)即可檢測，或將上(shang)清(qing)置(zhi)于-20℃或-80℃保存，但應(ying)避免反復凍(dong)融。

3.組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)勻(yun)漿(jiang)：用預冷的(de)(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)，去除殘留血(xue)液（勻(yun)漿(jiang)中裂解的(de)(de)(de)紅細胞(bao)會影響測(ce)量(liang)結(jie)果），稱重后將組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)剪碎。將剪碎的(de)(de)(de)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)與對(dui)應體(ti)積的(de)(de)(de)PBS（一(yi)般按1:9的(de)(de)(de)重量(liang)體(ti)積比，比如1g的(de)(de)(de)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)樣(yang)品對(dui)應9mL的(de)(de)(de)PBS，具體(ti)體(ti)積可根據實驗(yan)需(xu)要適當(dang)調整(zheng)，并(bing)做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白(bai)酶抑(yi)制劑）加入玻璃(li)勻(yun)漿(jiang)器中，于冰(bing)上充(chong)分(fen)研磨。為(wei)了(le)進(jin)一(yi)步(bu)裂解組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)細胞(bao)，可以(yi)對(dui)勻(yun)漿(jiang)液進(jin)行超聲破碎，或反復(fu)凍(dong)融。將勻(yun)漿(jiang)液于5000×g離心5~10分(fen)鐘，取(qu)上清檢測(ce)。

4.細(xi)胞(bao)培養物上(shang)清：請1000×g離心20分鐘，取(qu)上(shang)清即(ji)可檢(jian)測，或將上(shang)清置(zhi)于-20℃或-80℃保(bao)存，但應避免反復凍(dong)融。

5.其(qi)它生物標(biao)本：1000×g離心20分鐘，取上清即(ji)可(ke)檢測。

6.樣(yang)品外觀：樣(yang)品應清澈(che)透明，懸浮物(wu)應離(li)心去除。

7.樣品保(bao)存：樣品收集后若(ruo)在1周內進行檢測(ce)的(de)可保(bao)存于4℃，若(ruo)不能及時檢測(ce)，請按一次使用(yong)量分裝，凍存于-20℃（1個(ge)(ge)月(yue)內檢測(ce)），或-80℃（6個(ge)(ge)月(yue)內檢測(ce)），避免反復凍融，標(biao)本(ben)溶血會(hui)影響檢測(ce)結果(guo)，因此溶血標(biao)本(ben)不宜(yi)進行此項檢測(ce)。

注意事(shi)項：

1.嚴(yan)格(ge)按照規定(ding)的(de)時間(jian)和溫(wen)度進行溫(wen)育以保證準(zhun)確結果。所有試(shi)劑都(dou)必須在使(shi)用前達到(dao)室溫(wen)20-25℃。使(shi)用后立即(ji)冷(leng)藏保存試(shi)劑。

2.洗板不正(zheng)確可(ke)以導(dao)致不準(zhun)確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔(kong)內液體。溫育過程中(zhong)不要讓微(wei)孔(kong)干燥掉。

3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4.底物顯色(se)液應呈無色(se)或很(hen)淺的(de)顏色(se)，已經變藍的(de)底物液不能使用。

5.避(bi)免試劑和標本的交叉(cha)污(wu)染以免造成(cheng)錯誤結果。

6.在(zai)儲存和溫育時(shi)避免強光(guang)直(zhi)接照射。

7.平(ping)衡至室溫后再打(da)開密(mi)封袋以(yi)防水滴(di)凝(ning)聚在冷板(ban)條(tiao)上(shang)。

8.任何反應(ying)試(shi)劑(ji)(ji)不能接觸漂(piao)(piao)(piao)白(bai)溶劑(ji)(ji)或漂(piao)(piao)(piao)白(bai)溶劑(ji)(ji)所散發的強烈氣體。任何漂(piao)(piao)(piao)白(bai)成分(fen)都會(hui)破壞試(shi)劑(ji)(ji)盒中反應(ying)試(shi)劑(ji)(ji)的生物活(huo)性。

9.不能使(shi)用過期產(chan)品。

10.如果可(ke)能傳播疾病(bing)，所有的樣品(pin)都(dou)應管理好，按照規(gui)定的程序處(chu)理樣品(pin)和檢測裝置(zhi)。

操(cao)作(zuo)步驟：

1．從室溫平衡(heng)60min后的鋁(lv)箔袋中取出所(suo)需板(ban)條(tiao)(tiao)，剩余板(ban)條(tiao)(tiao)用(yong)自封袋密(mi)封放回4℃。

2．設置(zhi)標準品孔(kong)和樣本(ben)孔(kong)，標準品孔(kong)各加不同濃(nong)度的(de)標準品50μL。

3．樣本孔(kong)(kong)中a加(jia)入待測樣本50μL；空白孔(kong)(kong)不加(jia)。

4．除空白(bai)孔(kong)(kong)(kong)(kong)外(wai)，標準品孔(kong)(kong)(kong)(kong)和樣本孔(kong)(kong)(kong)(kong)中每孔(kong)(kong)(kong)(kong)加(jia)入辣根過氧化物酶（HRP）標記的(de)檢測(ce)抗體(ti)100μL，用封(feng)板膜封(feng)住反應孔(kong)(kong)(kong)(kong)，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5．棄(qi)去液體，吸水紙上拍(pai)干，每孔(kong)加滿洗(xi)(xi)(xi)滌(di)液（350μL），靜置1min，甩去洗(xi)(xi)(xi)滌(di)液，吸水紙上拍(pai)干，如此重復洗(xi)(xi)(xi)板5次（也可用洗(xi)(xi)(xi)板機洗(xi)(xi)(xi)板）。

6．每孔加入底(di)物(wu)A、B各50μL，37℃避光孵(fu)育15min。

7．每孔加入終止(zhi)液50μL，15min內，在(zai)450nm波長處測(ce)定各孔的OD值。

實驗結(jie)果計算：

繪制(zhi)標(biao)準曲線(xian)：在(zai)Excel工作表中，以(yi)標(biao)準品濃(nong)度(du)(du)作橫(heng)坐標(biao)，對應OD值作縱坐標(biao)，繪制(zhi)出標(biao)準品線(xian)性(xing)回(hui)歸曲線(xian)，按(an)曲線(xian)方程計算各樣(yang)本濃(nong)度(du)(du)值。

（此圖(tu)僅供參考）

人Ⅴ型膠原(yuan)(COL5)試(shi)劑盒性(xing)能：

1. 檢測(ce)范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈敏(min)度：檢測濃(nong)度小(xiao)于1.0 pg/mL。

3.特異性(xing)：不與其(qi)它可溶(rong)性(xing)結構類似物交叉反應(ying)。

4.重復性：板(ban)內(nei)變(bian)異系(xi)數小于10% ，板(ban)間變(bian)異系(xi)數小于15% 。

技術小提示：

1.當(dang)混(hun)合或重(zhong)溶(rong)蛋(dan)白溶(rong)液時，盡量避免起沫(mo)。

2.為(wei)了避免交叉感(gan)染，配置不同(tong)濃度(du)標準品、上樣、加不同(tong)試(shi)劑(ji)都需要更(geng)換槍頭。另外不同(tong)試(shi)劑(ji)請(qing)分別(bie)使(shi)用(yong)不同(tong)的(de)移(yi)液槽。

3.每次孵育(yu)時，請(qing)正(zheng)確(que)(que)使用封板膠可保證結果的準確(que)(que)性。

4.混合后(hou)(hou)的(de)顯色底物在(zai)上板(ban)(ban)前應為無色，請(qing)避光(guang)保(bao)存；假如微孔板(ban)(ban)后(hou)(hou)，將由物色變成不同深度的(de)藍色。

5.終止液上(shang)板順(shun)序應(ying)同顯色(se)底物上(shang)板順(shun)序一致(zhi)；加(jia)入終止液后，孔內(nei)顏色(se)由藍變黃；若孔內(nei)有綠色(se)，則(ze)表(biao)明孔內(nei)液體未混勻；請充分混合。

說(shuo)明(ming)：

1.由于現有條件(jian)及科學技(ji)術(shu)水平尚(shang)不能對所有供貨(huo)商提(ti)供的(de)(de)所有原料進行(xing)全面的(de)(de)鑒定與分析(xi)，本產品可能存在(zai)一定的(de)(de)質量技(ji)術(shu)風險。

2.實驗(yan)(yan)結(jie)果(guo)與試劑的(de)有效性、實驗(yan)(yan)者的(de)相關操作以及當時的(de)實驗(yan)(yan)環境密(mi)切相關，請務必準備充(chong)足的(de)標本(ben)備份。

3.不(bu)同批次的同一產品可能會有少許差(cha)別，如：檢測限、靈敏度(du)以(yi)及顯色時間等，請依據試劑盒內(nei)說明書進行實(shi)驗操(cao)作，網站電(dian)子(zi)版說明書僅作參考。

4.只有全部使用本(ben)試劑盒(he)配(pei)套(tao)試劑才能(neng)保證檢(jian)測(ce)效果(guo)(guo)，不能(neng)混用其(qi)他制造商的(de)產品。只有嚴(yan)格(ge)遵守(shou)本(ben)試劑盒(he)的(de)實(shi)驗說(shuo)明才會得到的(de)檢(jian)測(ce)結(jie)果(guo)(guo)。