本試劑盒(he)(he)用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及(ji)相關液體樣本中牛ATP結合盒(he)(he)轉運蛋(dan)白(bai)A2(ABCA2)的含量。

有效期：6個月

保存條件：2-8℃

牛ATP結合盒轉運蛋白A2(ABCA2)試(shi)劑盒組成：

備(bei)注：

1.（96T/48T）打開包裝后請及時檢(jian)查所(suo)有物品是否齊全。

2. 標準品濃度依次為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 經(jing)過(guo)大(da)量正常標本(ben)(ben)檢(jian)驗，標本(ben)(ben)的(de)正常濃(nong)(nong)度值(zhi)均在(zai)試(shi)劑盒(he)提(ti)供的(de)檢(jian)測范圍內，實驗過(guo)程中(zhong)直接(jie)取50μL樣(yang)本(ben)(ben)上樣(yang)即可(ke)。當有部分樣(yang)本(ben)(ben)值(zhi)超過(guo)大(da)標準品濃(nong)(nong)度時(shi)，可(ke)用樣(yang)本(ben)(ben)稀釋液將標本(ben)(ben)進(jin)(jin)行適當稀釋后(hou)再進(jin)(jin)行實驗。

檢(jian)測前準(zhun)備工作：

1.請提前20分鐘(zhong)從冰箱中(zhong)取出試劑盒，平(ping)衡至室溫。

2.從冰箱中取出的濃(nong)縮洗滌液可能有結晶，屬于正(zheng)常(chang)現象；放(fang)置(zhi)室溫，輕搖均勻，待結晶溶(rong)解后(hou)再配置(zhi)洗滌液。可將20ml濃(nong)縮洗滌液用蒸餾水(shui)或去離子水(shui)稀釋配置(zhi)成400ml工作(zuo)濃(nong)度的洗滌液，未用完的放(fang)回(hui)4℃

3.20×洗滌(di)(di)緩沖(chong)液的稀釋：蒸餾(liu)水按1：20稀釋，即1份(fen)20×洗滌(di)(di)緩沖(chong)液加19份(fen)蒸餾(liu)水。

實驗原理：

試(shi)劑盒采(cai)用雙抗體一(yi)步夾心法(fa)酶(mei)(mei)(mei)聯免(mian)疫吸附試(shi)驗（ELISA）。往預(yu)先包被(bei)牛(niu)ATP結(jie)合盒轉運蛋白A2(ABCA2)捕獲(huo)抗體的(de)包被(bei)微孔中，依(yi)次(ci)加入標(biao)本、標(biao)準(zhun)品、HRP標(biao)記的(de)檢測(ce)抗體，經過溫育并(bing)洗滌。用底(di)物(wu)TMB顯色(se)，TMB在(zai)過氧化物(wu)酶(mei)(mei)(mei)的(de)催化下(xia)轉化成(cheng)藍色(se)，并(bing)在(zai)酸的(de)作用下(xia)轉化成(cheng)的(de)黃(huang)色(se)。顏色(se)的(de)深淺和樣品中的(de)牛(niu)ATP結(jie)合盒轉運蛋白A2(ABCA2)呈正(zheng)相關(guan)。用酶(mei)(mei)(mei)標(biao)儀在(zai)450nm 波(bo)長(chang)下(xia)測(ce)定吸光(guang)度（OD 值），計(ji)算樣品濃度。

實驗所需(xu)自備試驗器材：

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣器(qi)及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸(zheng)餾(liu)水或去(qu)離子水

牛ATP結合(he)盒(he)轉(zhuan)運蛋白(bai)A2(ABCA2)試(shi)劑盒(he)樣本處理(li)及要求：

1.血清(qing)(qing)：將(jiang)收集于血清(qing)(qing)分離(li)管的全(quan)血標本在室溫放置2小時或(huo)4℃過夜，然后1000×g離(li)心(xin)20 分鐘，取上清(qing)(qing)即(ji)可，或(huo)將(jiang)上清(qing)(qing)置于-20℃或(huo)-80℃保存(cun)，但(dan)應避免反(fan)復凍(dong)融。

2.血漿：用EDTA或(huo)肝素作為抗(kang)凝劑采集(ji)標本(ben)，并將標本(ben)在采集(ji)后的30分鐘內于(yu)2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清(qing)即(ji)可檢(jian)測，或(huo)將上清(qing)置于(yu)-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融(rong)。

3.組(zu)織(zhi)勻(yun)(yun)漿(jiang)：用預冷的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組(zu)織(zhi)，去(qu)除(chu)殘留血(xue)液(ye)（勻(yun)(yun)漿(jiang)中裂(lie)解的(de)紅細(xi)胞會影響(xiang)測量(liang)結果），稱重后(hou)將(jiang)(jiang)組(zu)織(zhi)剪碎(sui)。將(jiang)(jiang)剪碎(sui)的(de)組(zu)織(zhi)與對(dui)應(ying)體(ti)積的(de)PBS（一般按1:9的(de)重量(liang)體(ti)積比，比如1g的(de)組(zu)織(zhi)樣品對(dui)應(ying)9mL的(de)PBS，具體(ti)體(ti)積可根據實驗(yan)需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加(jia)入蛋白(bai)酶(mei)抑(yi)制劑）加(jia)入玻璃勻(yun)(yun)漿(jiang)器(qi)中，于冰(bing)上(shang)(shang)充(chong)分研磨。為了進一步裂(lie)解組(zu)織(zhi)細(xi)胞，可以對(dui)勻(yun)(yun)漿(jiang)液(ye)進行(xing)超聲破碎(sui)，或反復凍融。將(jiang)(jiang)勻(yun)(yun)漿(jiang)液(ye)于5000×g離心5~10分鐘，取上(shang)(shang)清檢測。

4.細胞培(pei)養物上(shang)清(qing)：請(qing)1000×g離(li)心20分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清(qing)即(ji)可檢測(ce)，或將上(shang)清(qing)置于-20℃或-80℃保存，但應避(bi)免反(fan)復(fu)凍融。

5.其它生物標本：1000×g離心20分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清即可(ke)檢測。

6.樣品外觀(guan)：樣品應清(qing)澈透(tou)明，懸(xuan)浮(fu)物應離心去除(chu)。

7.樣品(pin)保存：樣品(pin)收集(ji)后若(ruo)(ruo)在1周內進行檢(jian)(jian)測(ce)的可保存于4℃，若(ruo)(ruo)不能及時檢(jian)(jian)測(ce)，請(qing)按一次(ci)使(shi)用量分裝，凍存于-20℃（1個(ge)月內檢(jian)(jian)測(ce)），或-80℃（6個(ge)月內檢(jian)(jian)測(ce)），避免反復凍融，標本溶血會影響檢(jian)(jian)測(ce)結果，因此溶血標本不宜進行此項檢(jian)(jian)測(ce)。

注(zhu)意事項：

1.嚴格(ge)按照規定(ding)的時間和溫度進行溫育以保證準(zhun)確結果。所(suo)有試(shi)(shi)劑(ji)都必須在使(shi)用前達到室溫20-25℃。使(shi)用后(hou)立即冷藏保存試(shi)(shi)劑(ji)。

2.洗板不(bu)(bu)正確(que)可(ke)以導(dao)致不(bu)(bu)準確(que)的結果(guo)。在(zai)加(jia)入底物(wu)前確(que)保盡量吸干(gan)孔內液(ye)體。溫(wen)育過(guo)程中不(bu)(bu)要讓微(wei)孔干(gan)燥掉。

3.消除板底殘留的(de)液體和手指(zhi)印，否則(ze)影響OD值。

4.底物顯色液應呈無(wu)色或(huo)很淺的(de)顏色，已經變藍的(de)底物液不能使用。

5.避(bi)免試(shi)劑和(he)標本的交叉污染(ran)以免造成錯誤(wu)結果。

6.在儲存(cun)和溫育時避免(mian)強光直接照射。

7.平(ping)衡(heng)至(zhi)室溫后再打開(kai)密(mi)封袋(dai)以防水滴凝聚在冷(leng)板(ban)條上。

8.任何(he)(he)反(fan)應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的(de)強烈氣體(ti)。任何(he)(he)漂白成分都會破壞試劑盒中(zhong)反(fan)應試劑的(de)生物活性。

9.不(bu)能使(shi)用過期產品。

10.如果可能傳播疾(ji)病(bing)，所(suo)有的(de)樣(yang)品都應管理好，按照規定的(de)程序處(chu)理樣(yang)品和(he)檢測裝置。

操作步驟：

1．從室(shi)溫平衡60min后的鋁(lv)箔袋(dai)中取出(chu)所需板條，剩余板條用自封袋(dai)密(mi)封放回4℃。

2．設置標(biao)準(zhun)品(pin)孔(kong)和樣本(ben)孔(kong)，標(biao)準(zhun)品(pin)孔(kong)各(ge)加不同濃(nong)度的標(biao)準(zhun)品(pin)50μL。

3．樣本(ben)孔(kong)(kong)中a加(jia)入待測(ce)樣本(ben)50μL；空(kong)白孔(kong)(kong)不加(jia)。

4．除空白孔(kong)外，標(biao)(biao)準品孔(kong)和樣本孔(kong)中每孔(kong)加入辣根過氧(yang)化物(wu)酶（HRP）標(biao)(biao)記的檢測抗體100μL，用(yong)封(feng)板膜封(feng)住反應孔(kong)，37℃水浴鍋或恒(heng)溫(wen)箱溫(wen)育60min。

5．棄去液體，吸水(shui)紙上拍干，每(mei)孔加滿洗(xi)(xi)滌液（350μL），靜置1min，甩(shuai)去洗(xi)(xi)滌液，吸水(shui)紙上拍干，如此重復(fu)洗(xi)(xi)板(ban)5次（也可(ke)用洗(xi)(xi)板(ban)機洗(xi)(xi)板(ban)）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育(yu)15min。

7．每孔(kong)(kong)加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測(ce)定各孔(kong)(kong)的OD值。

實(shi)驗結果計算：

繪(hui)制(zhi)標(biao)(biao)準(zhun)曲線：在Excel工(gong)作(zuo)(zuo)表(biao)中，以標(biao)(biao)準(zhun)品濃度作(zuo)(zuo)橫坐標(biao)(biao)，對應(ying)OD值(zhi)作(zuo)(zuo)縱坐標(biao)(biao)，繪(hui)制(zhi)出(chu)標(biao)(biao)準(zhun)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣(yang)本濃度值(zhi)。

（此(ci)圖僅供參考(kao)）

性能：

1. 檢測(ce)范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.靈(ling)敏度：檢測濃度小于1.0 pg/mL。

3.特異性：不與其(qi)它(ta)可溶性結(jie)構類似物交叉反應。

4.重復(fu)性：板(ban)內變異系數小于10% ，板(ban)間變異系數小于15% 。

技術小提示：

1.當混合(he)或重溶蛋白溶液時，盡量避免起沫。

2.為了避(bi)免交叉感染，配置不(bu)同(tong)濃度標準品、上(shang)樣、加不(bu)同(tong)試劑(ji)都需要更換槍頭。另外不(bu)同(tong)試劑(ji)請(qing)分別使用不(bu)同(tong)的移液槽(cao)。

3.每次(ci)孵育時，請(qing)正確(que)使用封板膠可(ke)保證(zheng)結果的準確(que)性。

4.混合后的顯(xian)色底(di)物(wu)在(zai)上(shang)板前應為無色，請避光保存(cun)；假(jia)如微孔(kong)板后，將由物(wu)色變成不同深度的藍色。

5.終止(zhi)液上板順(shun)(shun)序應同顯色底物上板順(shun)(shun)序一致；加入終止(zhi)液后，孔(kong)內顏(yan)色由(you)藍變黃；若孔(kong)內有綠色，則表明孔(kong)內液體未混勻；請充分(fen)混合(he)。

說明：

1.由于現有(you)(you)條(tiao)件及(ji)科學技術水平尚不能(neng)(neng)對所(suo)(suo)有(you)(you)供貨商提供的所(suo)(suo)有(you)(you)原料(liao)進行全(quan)面的鑒定與分析，本(ben)產(chan)品可能(neng)(neng)存在一定的質量技術風險。

2.終的(de)(de)實(shi)驗(yan)(yan)結果與(yu)試劑的(de)(de)有效性(xing)、實(shi)驗(yan)(yan)者的(de)(de)相(xiang)關操作(zuo)以及當時的(de)(de)實(shi)驗(yan)(yan)環境密(mi)切相(xiang)關，請務必準備充足的(de)(de)標本備份。

3.不(bu)同批(pi)次的同一產(chan)品可能(neng)會有少許差別，如：檢(jian)測(ce)限、靈(ling)敏(min)度以及顯(xian)色時(shi)間等，請依(yi)據試劑(ji)盒內說(shuo)明書進行實驗操(cao)作(zuo)，網站電(dian)子版說(shuo)明書僅(jin)作(zuo)參(can)考。

4.只有(you)全(quan)部使用本(ben)試(shi)劑盒配套試(shi)劑才(cai)能保證檢測效果(guo)，不能混用其(qi)他(ta)制造商的產品。只有(you)嚴(yan)格遵守本(ben)試(shi)劑盒的實驗說(shuo)明才(cai)會(hui)得到檢測結果(guo)。